因此，本文通过计算机辅助设计，对来自Rhodotorula paludigena JNU001的环氧化物水解酶(RpEH)的底物结合袋(SBP)内特定残基进行靶向突变。并研究了RpEH突变体催化苯乙烯氧化物（SO）进行区域选择性水解的工业应用。此外，作者通过分子动力学（MD）模拟，初步解释了RpEH-I194F对(S)-SO的区域选择性逆转的机制。

具体的研究过程如下：

利用RpEH的湿细胞催化rac-SO进行水解反应，可生成(R)-苯基-1,2-乙二醇，转化率为93.6%，说明该酶对R构型产物有立体选择性，产物ee值为67.8%。同时测定了(S)-和(R)-SO的区域选择性系数α_S和β_R值（计算公式如下[1]）。结果表明，RpEH具有较高的β_R值（90.8%），对(S)-SO区域选择性系数α_S值（77.0%）较低。

(R)-SO的区域选择性系数用α_R和β_R表示，α_R=[S_p/(R_p+S_p)]×100%，α_R+β_R=100%；

其中，R_p和S_p分别表示R型产物和S型产物的浓度。

将194和360位点的残基分别替换为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Asn、Val、Trp和Tyr，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，而后将重组菌体进行培养、诱导表达。通过RpEH野生型(WT)及突变体酶对rac-SO底物的水解反应，最终筛选到了2个较优突变体RpEH-L360V和RpEH-L360F，比WT的水解活性分别提高了102%和114.4%（如图2）。

表1. RpEH野生型(WT)及其突变体对rac-SO的转化率、

ee值和区域选择性系数

图3. RpEH（左）和RpEH-I194F（右）

RpEH-I194F攻击原子的改变是因为在RpEH-I194F-(S)-SO中，Ile194被Phe取代，改变了邻近Trp191的构象，增加了其与(S)-SO的Pi-Pi相互作用的频率，这些频繁的分子间相互作用引起了(S)-SO的构象变化，使其Cβ原子更靠近亲核Asp190（如图4），从而逆转RpEH-I194F的区域选择性。

图4. RpEH和RpEH-I194F与(S)-SO的

由于突变体RpEH-L360V具有较高的α_S值（96.9%），而RpEH-I194F具有较高的β_S值（98.8%），且均具有较高的催化活性，因此将这两个突变体分别应用于底物(S)-1a的区域选择性水解反应，以合成手性苯基-1,2-乙二醇（(R)-1b和(S)-1b），具体反应路线如图5。

(S)-环氧化物1a水解的反应路线

表2.RpEH-L360V和RpEH-I194F的最佳反应条件及结果

本文总结：本文通过对环氧化物水解酶(RpEH)的定点突变以调节突变体的区域选择性，最终筛选得到2个突变体RpEH-L360V和RpEH-I194F，他们的催化活性高，且具有不同的区域选择性。将RpEH-L360V和RpEH-I194F分别应用于(R)-和(S)-苯基-1,2-乙二醇的克级合成，均获得了大于99%转化率。此外，本文还通过MD模拟初步分析了突变体RpEH-I194F区域选择性逆转的机制。

参考文献：